MICROBIOLOGIA
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
O técnico deverá entrar na sala de cultivo "OBRIGATORIAMENTE", usando avental e de preferência de cabelos presos. Lembre-se que de alguma forma você estará em contato com microrganismos, e portanto deve tomar todo cuidado para evitar se contaminar, ou transmitir infecção à pessoas do seu convívio.
A bancada de trabalho deve estar o mais desimpedida possível, portanto é adequado que não se coloque nela cadernos, bolsas e apontamentos que não serão utilizados durante a fase experimental, evitando assim acidentes e deixando o local livre para manuseio do material em estudo.
Em todos os trabalhos práticos, observe os seguintes critérios:
a) Bico de Bunsen com chama azulada. A utilização deste, visa flambar a alça ou a agulha bacteriológica e propiciar um ambiente asséptico ao redor do material que você manuseará, evitando assim resultados indesejáveis e diminuindo o risco de infecção por aspiração de partículas. Para isso, no entanto, é necessário que você trabalhe sentado, com a chama a sua frente e não a distância do seu manuseio, pois caso contrário ela somente servirá para aquecer o ambiente, ou provocar acidentes com fogo, e esse fato indesejável só depende do "seu cuidado".
b) Alça ou agulha bacteriológica devem ser flambadas até o rubor, antes e após cada experimento. Saiba que antes elas são flambadas, para evitar resultados indesejáveis ao seu estudo, pois microrganismos contaminantes do ar, podem estar assentados sobre o material; e depois, a flambagem é obrigatória, pois esse material posteriormente poderá contaminar outras pessoas, como colegas, professores e o pessoal da limpeza.
c) Sempre que você utilizar pipetas, lâminas e outros materiais que não podem ser esterelizados por calor seco (flambagem), solicite ao microbiologista, a orientação quanto ao local adequado onde você deverá desprezá-los. Nunca abandone-os sobre a bancada, pois você a estará contaminando e pessoas desavizadas pagarão pelo seu descuido.
d) Sempre que houver algum acidente, como quebra de tubos ou placas com microrganismos, contato com material contaminado, etc..., não se desespere, não se esqueça de avisar o microbiologista, para que ele tome providências imediatas, dependendo do caso ou acidente, e jamais seja relaxado com os cuidados pessoais.
e) Ao final de todo trabalho prático, não se esqueça de lavar as mãos com água e sabão e posteriormente, álcool-iodado. Além de ser um critério básico de higiene, você poderá notar o quanto isto é importante.
2. PROCEDIMENTOS TÉCNICOS GERAIS
a) Flambagem de alça ou agulha bacteriológica
Procure executar esse procedimento colocando o instrumento sobre a chama, numa inclinação aproximada de 45º e nunca em posição horizontal, pois desta última forma você estará esterilizando apenas a porção final, e geralmente você contamina muito mais do que isso ao introduzir a alça num tubo contaminado.
b) Abrir o tubo de cultura
Para os dextros: segure o tubo com a mão esquerda e retire o tampão de algodão com os dedos mínimo e anelar da mão direita, deixando livres os dedos médio, indicador e polegar para manuseio da alça bacteriológica ou pipeta, evitando assim deixar o tampão sobre a bancada o que levaria à sua contaminação.
c) Abrir placas de Petri
Coloque a placa fechada sobre a bancada, com a tampa para baixo. Retire o fundo da placa com a mão esquerda e assim você terá a mão direita livre para semear microrganismos na superfície do meio de cultura.
d) Semeadura por esgotamento
Semeie o material contido numa alça bacteriológica ou num "swab", num dos cantos da placa, em movimentos de vai e vem. Gire a placa 90º e repita esses movimentos atingindo apenas um dos cantos. Gire novamente a placa, e repita o procedimento anterior. No 4º canto da placa, faça um zigue-zague largo. Com isso você obtém colônias isoladas.
e) Semeadura em profundidade, em tubo
Semeie o material contido numa agulha bacteriológica fazendo picadas até o fundo do tubo. Com isso você propicia o crescimento de microrganismos em anaerobiose.
f) Confecção de um bom esfregaço
Desengordure a lâmina, passando-a levemente pela chama e limpando-a com papel absorvente. Coloque no centro da lâmina o material a ser corado, evitando a concentração excessiva num único local, mas proporcionando a obtenção de um esfregaço denso (algumas vezes você terá que usar mais que uma alçada). A seguir passe pela chama a parte oposta da lâmina, para fixar o esfregaço que estará pronto quando todo o material estiver seco. Não esqueça de identificar o lado da lâmina onde você fez o esfregaço. A seguir, realize a coloração desejada.
3. COLHEITA, PRESERVAÇÃO E TRANSPORTE DE ESPÉCIMES.
3.1. PRINCÍPIOS GERAIS
A colheita, a conservação e o transporte do material clínico constituem a base de todo o trabalho microbiológico, que culmina com a definição etiológica do processo infeccioso. Assim, é importante a participação do laboratório de Microbiologia na normalização e supervisão desses procedimentos.
Considerando a grande especificidade dos testes microbiológicos, torna-se fácil entender que o laboratório deve sempre trabalhar sob as hipóteses etiológicas formuladas para cada caso. Nesse sentido, a comunicação adequada entre o médico e o microbiologista torna-se de grande importância, uma vez que nenhum dos métodos disponíveis isola todos os microrganismos patogênicos conhecidos nem os diferencia dos não patogênicos.
A escolha de determinado exame microbiológico deve sempre levar em conta a fase da doença suspeita, pois, dependendo da mesma, haverá maior chance de isolar o agente etiológico específico.
Vários cuidados devem ser observados na colheita de material clínico: a amostra deverá ser obtida em quantidade suficiente, (principalmente se houver solicitação de muitos exames), antes da antibioticoterapia, em condições rigorosas que evitem contaminação, entre outros.
A manutenção e transporte adequado do material colhido, é de vital importância na recuperação do agente infeccioso. O meio de transporte empregado deverá manter a viabilidade bacteriana, mas não deve permitir sua multiplicação.
Ao receber as amostras clínicas, o laboratório deve determinar a ordem de prioridade para o processamento dos mesmos e o método de conservação para aqueles que não tiverem seguimento imediato.
Por outro lado, é preciso que o clínico solicitante dê especial atenção aos processos de colheita, conservação e transporte das amostras, orientando o paciente e aqueles que atuam normalmente nessas atividades, de modo a assegurar eficácia nos procedimentos laboratoriais propriamente ditos.
3.2. Colheita de material
a) O material deve ser representativo do processo infeccioso investigado, devendo ser eleito o melhor sítio da lesão. Por exemplo: as crostas e exsudatos das feridas devem ser removidos, uma vez que a amostra apropriada vai localizar-se abaixo desse material. Além disso, devem ser tomadas as devidas precauções para evitar a contaminação extrínseca nas punções de tecidos íntegros ou cavidades fechadas.
b) A colheita da amostra deve ser realizada, sempre que possível, antes do início ou modificação de antibioticoterapia.
c) Quando viável, preferir a colheita por aspiração com seringa e agulhas em substituição ao "swab"ou zaragatoa, o que reduz o risco de contaminação e de dessecação da amostra.
3.3. Conservação e transporte de material clínico
a) após a colheita, o material deve ser transportado ao laboratório no menor tempo possível.
b) Materiais em que se suspeite da presença de bactérias mais sensíveis às variações de temperatura ou umidade, como: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, etc..., devem ser colhidos em meios de transporte ou nos próprios meios de cultura.
c) Os agentes infecciosos mais frequentemente relacionados com casos de infecção hospitalar (enterobactérias, estafilococos, bacilos gram-negativos não fermentadores, enterococos, fungos do gênero Candida e germes anaeróbios) toleram a refrigeração, desde que mantida a umidade por períodos de até duas horas.
d) Material naturalmente rico em flora microbiana (fezes e escarro) ou obtidos de sítios de difícil descontaminação (urina, secreções genitais, secreções de orofaringe, lesões superficiais abertas, etc...), deve ser transportado com os cuidados necessários à manutenção da proporção da flora original. Este material, quando mantido à temperatura ambiente por período superior a 20 minutos, pode ser prejudicado pela proliferação da flora bacteriana (microbiota) e pela dificuldade de isolamento dos germes patogênicos.
e) O material clínico proveniente de sítios estéreis (sangue, líquor, líquido ascítico, sinovial, etc...) deve ser colhido e semeado diretamente em meios de cultura, transportado à temperatura ambiente ao laboratório e colocado em estufa entre 35 e 37ºC. Na impossibilidade desse procedimento, colher o material em tubo de ensaio esterilizado e conservá-lo à temperatura ambiente, até o momento do uso.
f) O material colhido em meio de transporte é geralmente conservado em geladeira ou à temperatura ambiente, até seu processamento, com exceção de líquor e líquido sinovial.
g) Durante o transporte, as amostras devem ser protegidas da exposição aos extremos de temperatura, pressão (transporte aéreo), luz solar, dessecação e agitação.
h) Para o transporte a grandes distâncias ou em tempo superior a 20 minutos, de fezes, urina e outros materiais que exijam refrigeração, bem como secreções, aspirados de abscessos e outros materiais colhidos em meios de transporte (ágares, caldos nutrientes, etc...), deve-se utilizar um recipiente isolante-térmico (isopor) contendo sacos plásticos com gelo ou bolsa de gelo descartável. O líquor deverá ser semeado diretamente em meio de transporte.
a). Secreções de orofaringe e nasofaringe
Usar abaixador de língua e fazer esfregaços sobre as amígdalas e faringe posterior, usando "swab" estéril, evitando-se tocar na língua ou bochechas. Procurar material nas áreas com hiperemia, adjacentes aos pontos de supuração ou remover o pus ou placas, colhendo o material na mucosa logo abaixo. A contaminação com saliva, que contém flora bacteriana rica, pode dificultar o isolamento ou identificação do real agente infeccioso.
b) Secreções de mucosa ocular, de ouvido e genitais
Desprezar a secreção purulenta superficial, colher com "swab" e introduzir em meio de transporte, se não for possível a semeadura imediata. Sempre que possível, colher um esfregaço para bacterioscopia. Quando a secreção for escassa, semear direto. Em casos de úlcera de córnea, a área lesada deve ser raspada, através de instrumentos próprios, pelo oftalmologista, que procederá imediatamente a semeadura do material em meio apropriado, fazendo um único risco de implantação, para permitir leitura adequada. Secreção vaginal deve ser colhida com "swab" umedecido em salina, de fundo de saco vaginal, utilizando espéculo sem lubrificantes.
c) Escarro
Deve-se preferir o primeiro escarro da manhã, antes da higiene oral e da ingestão de alimentos, obtidos após tosse profunda. Pode-se, antes da colheita, gargarejar com água para reduzir a contaminação pela saliva. O material deve ser colhido em frasco esterilizado de boca larga com tampa rosqueada, enviada e processada o mais rapidamente possível ou conservada a 4ºC, de 2 a 4 horas; pois períodos maiores podem comprometewr o isolamento de patógenos específicos. O escarro obtido por expectoração invariavelmente contamina-se pela flora buco-faringea, sendo desejável que se proceda a uma avaliação prévia da viabilidade do material. As amostras que, ao exame microscópico, revelem apenas presença de saliva, devem ser desprezadas. Fazer um esfregaço selecionando o material purulento, se presente, ou aquele que for representativo. Fazer uma coloração de Gram e observar ao microscópio de baixo aumento (objetiva 40X). Se houver predomínio de células epiteliais ou o número médio de neutrófilos por campo for inferior a 25, trata-se de material impróprio para cultura, devendo ser desprezado.
d) Aspirado transtraqueal
2 a 4 ml de solução de Ringer-lactado ou soro fisiológico estéril são injetados pela traquéia, através da membrana cricotiroideana, com seringa adaptada a cateter plástico. Imediatamente após surgir um paroxismo de tosse, aspiram-se as secreções produzidas. O material obtido por aspiração transtraqueal ou através da parede torácica, ou ainda por broncoscopia, são mais representativos e sofrem menor risco de contaminação, particularmente os dois primeiros. A indicação de tais métodos restringe-se aos casos da ocorrência de falha terapêutica ou quando a definição etiológica se fizer imprescindível ou quando se pretenda o isolamento de germes anaeróbios. O material deve ser colhido e transportado na própria seringa ou em frasco esterilizado, observando-se o mesmo cuidado de conservaçãoo do ítem anterior. Em casos de cultura para recuperação de bactérias anaeróbias, adotem-se as indicações pertinentes, descritas adiante.
e) Líquor (líquido cefalorraquidiano - LCR)
A punção lombar deve ser feita sob condições estritas de assepsia, empregando-se solução de álcool iodado a 1%. O líquor deve ser colhido e semeado diretamente em meios de cultura, visto que uma demora superior a 10 minutos pode inviabilizar o isolamento de alguns germes patogênicos (meningococos e hemófilos). Não havendo disponibilidade de meios de cultura para semeadura imediata, o líquor deve ser colhido em tubo de ensaio estéril e conservado à temperatura ambiente e transportado, assim que possível, ao laboratório. Para cultivo de micobactérias, é necessária a colheita de volumes maiores de líquor, que deverão ser centrifugados ou concentrados por meio de membranas filtrantes, antes da semeadura. O material deverá ser transportado imediatamente ao laboratório e conservado a 4 ºC, até o processamento. É indispensável a realização de um esfregaço das amostras purulentas ou das não purulentas após centrifugação para exame bacterioscópico.
f) Hemoculturas
Deve-se observar com rigor a anti-sepsia da pele com álcool iodado a 1%, seguida da remoção do iodo com álcool a 70%. A relação sangue/meio de cultura deve ser 1:10, podendo, no entanto, chegar a 1:15. Habitualmente, usam-se frascos lacrados, contendo 50 ml de caldo BHI ("Brain Heart Infusion") ou caldo tripticase-soja, devendo-se adicionar o polianetol-sulfonato de sódio(PSS) a 0,025 ou 0,05%, como anticoagulante. Para adultos, semeiam-se de 5 a 10 ml de sangue para frascos com 50 - 100 ml de meio de cultura e, para crianças de até um ano, podem ser colhidos de 1 a 5 ml. Quando disponível frasco para cultura de anaeróbios, repetir o mesmo procedimento, utilizando frascos com caldo BHI ou TSB com suplemento e CO2,, tomando-se o cuidado para evitar a entrada de ar no frasco. O número de amostras recomendado é de 2 para criança, 3 para adultos que não estejam fazendo uso de antibióticos e de 4 a 6 para pacientes neutropênicos ou já fazendo uso de antibióticos. No caso de haver necessidade de dar-se início à antibioticoterapia imediata, o número de amostras é de 2, uma em cada braço. O sangue assim colhido em meio de cultura apropriado deverá ser transportado imediatamente ao laboratório ou conservado em estufa, entre 35 e 37ºC.
g) Líquido ascítico, pleural, pericárdico e sinovial
Fazer rigorosa anti-sepsia no local da punção. Aspirar o material, colher 5 ml e semear em caldo BHI ou TSB (como para hemocultura), semear 2 a 3 gotas em ágar-chocolate (como para líquor) e semear em meio de cultura para anaeróbios, se disponível. Fazer esfregaço para bacterioscopia corada pelo Gram. Caso o material não seja purulento, colher volume maior, centrífugar a 5.000 rpm/15 minutos. Semear parte do sedimento em tubo contendo ágar-chocolate, ou suspeitando-se de tuberculose, em ágar Lowenstein-Jensen. Se possível, fazer bacterioscopia pela coloração de Gram e Ziehl-Neelsen. Para líquido ascítico, caso haja necessidade de uso de anticoagulante, usar heparina ou PSS. Na impossibilidade da semeadura direta destes materiais em meios de cultura, deve-se conservá-los à temperatura ambiente, até seu processamento.
h) Feridas superfíciais e cirúrgicas, abscessos e fístulas
A colheita de material superficial das regiões acima citadas por meio de "swab", provavelmente revelará flora contaminante. Justifica-se, por esse motivo, sempre que possível, remover a secreção superfícial com gaze estéril, aspirando material mais profundo por meio de agulha grossa e seringa. Caso necessário o uso de "swab", remover também a secreção superficial e realizar a colheita, mantendo-se o "swab" úmido com a adição de algumas gotas de soro fisiológico num tubo de ensaio ou enviando ao laboratório em meio de transporte. Na impossibilidade de processamento imediato, deve-se conservar o material a 4ºC, até o momento da semeadura.
i) Escamas de pele, unhas e cabelos
Fazer uma anti-sepsia prévia da pele com álcool 70%, e com um bisturi gasto ou a lateral de uma lâmina, raspar as bordas da lesão a fim de obter escamas cutâneas. Colocar o material entre duas lâminas limpas (de preferência esterilizadas), vedando-se as bordas das lâminas com fita crepe ou durex, para evitar perda do material. Os pelos devem ser retirados com pinça estéril. Antes de colher raspado de unha, fazer uma limpeza com água e sabão através do auxílio de uma escovinha. Cortar com tesoura a parte descolada da unha e com um bisturi gasto, raspar a área doente em contato com o leito ungueal. Colocar o material entre duas lâminas e vedá-las com fita crepe.
j) Coprocultura (fezes)
Caso o material obtido por evacuação e colhido em pote plástico, de preferência esterilizado ou desinfetado, possa chegar ao laboratório em espaço de tempo inferior a 2 horas, deve-se apenas conservá-lo em geladeira. Quando for "swab" anal ou quando o processamento implicar demora superior a 2 horas, utilizar a solução de salina glicerinada tamponada para conservação.
k) Urocultura
Colher as amostras de urina em frascos estéreis. O processamento laboratorial deve ser feito dentro de 20 minutos ou, se não for possívell, as amostras deverão ser conservadas à temperatura de 4ºC, até o momento da semeadura.
- Para os que não tem controle de micção, como no caso das crianças, fazer uso de saco coletor, masculino ou feminino. Deve-se fazer higienização prévia do períneo, coxas, nádegas e barriga, com água e sabão neutro. O saco coletor deve ser trocado a cada 30 minutos, caso não haja micção, repetindo-se a higienização do períneo.
- Nos demais casos, como para os adultos, fazer a higienização da genitália externa, com água e sabão neutro; enxugar com compressa estéril; colher o jato médio, preferentemente da primeira micção do dia.
- Apenas quando houver justificativas diagnósticas ou terapêuticas que indiquem a cateterização uretral, a urina colhida imediatamente após este procedimento poderá ser utilizada para cultivo. Em pacientes submetidos a cateterização crônica com sistema aberto, existe elevado risco de contaminação da urina com a flora colonizadora da uretra, ou do frasco coletor do sistema aberto.
- A punção suprapúbica, que é uma técnica invasiva, porém rápida, simples e segura (em mãos experientes), está indicada em casos duvidosos de infecção urinária que apresentam evidências clínicas, embora as culturas revelem contagens baixas de bactérias, em recém-nascidos ou crianças pequenas; quando há contra-indicação de cateterização, ou suspeita de infecção por bactérias anaeróbias ou fungos.
- Em pacientes cateterizados com sistema de drenagem fechado, pode-se colher a urina puncionando-se o cateter na proximidade da junção com o tubo de drenagem. Não se deve colher a urina da bolsa coletora.
l) Material clínico para pesquisa de anaeróbios
Não se recomenda a pesquisa de bactérias anaeróbias em materiais clínicos provenientes de sítios anatômicos naturalmente colonizados com tais microrganismos. Deve-se evitar, portanto, tentar recuperar germes anaeróbios em amostras clínicas como: fezes, urina obtida de jato médio, escarro e também material proveniente de infecções superfíciais, cavidade oral, genital, etc...
A colheita de espécimes clínicos deve ser feita, sempre que possível, por punção que empregue agulha e seringa, principalmente nos processos infecciosos fechados, onde o material é aspirado de sítios profundos, que se comunicam com a pele ou com a superfície das mucosas.
A pesquisa de bactérias anaeróbias é altamente indicada em hemoculturas, particularmente em pacientes com endocardite subaguda após extração dentária, septicemias associadas à manipulação do trato gastrintestinal, etc...
O encaminhamento do material aspirado deve ser precedido da eliminação do ar residual e introdução em frascos lacrados, submetidos previamente a vácuo e contendo CO2. Outra opção é transportar o material na própria seringa da colheita, com agulha obstruída, nos casos de processamento rápido.
5. COLORAÇÃO DE GRAM
Material: Reagentes de Gram: sol. cristal-violeta 2%; sol. aquosa de iodo (Lugol); mistura álcool-acetona; sol. alcoólica de safranina[1], Lâminas: Suporte para lâminas; alça de platina; Bico de Bunsen; Microscópio; Óleo de Imersão
Método:
· Cobrir a área do esfregaço com a solução de cristal-violeta por cerca de 1min.;
· Lavar com água corrente e escorrer o excesso de água;
· Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de 1 minuto;
· Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra incolor;
· Cobrir o esfregaço com a solução de safranina1 por cerca de 30 segundos;
· Lavar com água corrente;
· Deixar secar ao ar .
REAGENTES PARA COLORAÇÃO DE GRAM
Cristal Violeta
Solução A
Cristal-violeta.......... 2g
Álcool etílico ............ 20 ml
Solução B
Oxalato de amônio ...... 0,8g
Água destilada ............ 80 ml
MISTURA A + B
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Lugol
Iodo ...........................1g
Iodeto de potássio ...... 2g
água destilada ...... 300ml
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Contracorante
Solução estoque:
Safranina 2,5 g / 100ml
Solução uso: Diluir sol. estoque 1/10
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6. PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
No Laboratório de microbiologia clínica são utilizados os seguintes meios de cultura:
1. Caldo BHI ( Infuso cérebro coração) – Para coleta de secreções
2. Caldo Tioglicolato – Para anaeróbios
3. Ágar Mueller-Hinton – Para antibiograma e utilizado como base para ágar sangue
4. Ágar Sangue – para secreções
5. Ágar chocolate – Para isolamento de Neisseria em secreção vaginal e uretral
6. Ágar Thayer- Martins – Para isolamento de Neisseria em líquor
7. Ágar Cled – para urina
8. Ágar E. M. B – Para cultura de fezes (coprocultura)
9. Ágar SS – Meio diferencial para Salmonella e Shigella
10. Ágar Mac Conkey – Para coprocultura e urocultura. Isolamento de Gram-negativos
11. Ágar Sabourand – Para fungos
12. Ágar Lowenstein-Jensen – Para cultura de escarro. Pesquisa de tuberculose
O MODO DE PREPARAR E A FÓRMULA ESTÁ ESPECIFICADA NO RÓTULO DOS REAGENTES, FORNECIDOS PELOS FABRICANTES
Caldo Simples
Peptona.....................5,0g
Extrato de carne ......3,0g
Água destilada .... 1000ml
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Pesar os ingredientes, dissolver em água destildada e acertar o pH para 7,3. Distribuir em 2ml/tubo. Autoclavar 120°C por 15'. Manter em geladeira.
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Ágar Simples
Ágar.................... 15,0g
Peptona................. 5,0g
Extrato de carne ....3,0g
Água destilada ...1000ml
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Pesar os ingredientes e dissolver a quente. Acertar o pH para 7,3. Autoclavar 120°C por 15'. Distribuir em placas. Manter em geladeira.
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Ágar Sangue
Adicionar sangue de carneiro desfribinado no ágar nutriente fundido e resfriado a 55ºC, na proporção de 5%, ou seja, para cada 10ml do ágar nutriente adicionar 0,5ml do sangue. Homogeneizar e distribuir em placas.
Ágar Chocolate
Adicionar sangue de carneiro desfribinado no ágar nutriente fundido e resfriado a 70ºC, na proporção de 5%, ou seja, para cada 10ml do ágar nutriente adicionar 0,5ml do sangue. Homogeneizar e distribuir em placas.
Ágar Mueller Hinton
Composição (g/litro)
Infuso de carne .......300g
Casaminoácido .......17,5g
Amido......................1,5g
Ágar .........................17g
pH final 7,3
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Modo de preparação
Suspender 38,0g em 1000ml de água destilada ou deionizada e aquecer até ebulição para dissolver completamente. Esterilizar em autoclave durante 10 min., a 15 Atm pressão (121ºC), esfriar a 50ºC e distribuir em placas de Petri.
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Caldo BHI (Brain Heart Infusion)
Composição (g/litro)
Infuso de cérebro de carneiro...200g
Infuso de coração bovino ...... 250g
Peptona proteosa, Difco ......... 10g
Dextrose ................................... 2g
Cloreto de sódio ...................... 5g
Fosfato disódico .................... 2,5g
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Modo de preparação
Dissolver 37 gramas em um litro de água destilada ou deionizada. Agitar até completa dissolução. Esterilizar em autoclave durante 15 minutos a 15 atm.
pH final 7,4
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Meio P/ Teste de Motilidade
Triptose ................. 10,0g
Cloreto de sódio ...... 5,0g
Ágar-ágar ................ 5,0g
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Modo de preparação
Suspender 20g do pó em 1000ml de água destilada ou deionizada e aquecer até ebulição para dissolver completamente. Distribuir em tubos e esterilizar em autoclave durante 15 min., a 15 Atm pressão (121ºC), esfriar o meio com o tubo em posição vertical
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7. TÉCNICAS DE SEMEADURAS
Material: Alça de platina, meio sólido em placa (ágar Mueller-Hinton, ágar sangue, EMB, etc.,), tubos contendo 10ml de meio Mueller-Hinton, pipetas de 1ml, tubos com 4,5ml de salina estéril, alça de Drigalsky, bico de Bunsen, swab esteril, galeria para tubos de ensaio, placas de Petri estéreis, becker de 100ml com álcool, estufa a 37ºC, banho-maria a 100ºC, material biológico (saliva, sec. nasal, sec.ouvido, sec.orofaringe, fezes, urina, etc.)
Métodos:
Técnica de Esgotamento: A mais utilizada para isolamento de germes em meio sólido (ágar sangue, ágar EMB, etc ), onde se utiliza uma alça de platina, previamente flambada e esfriada
Ä Com a alça de platina, tocar suavemente na amostra.
Ä Passar a alça sobre o meio de cultura em movimento de zigue-zague sem sobrepor as linha e sem recarregar a Alça[2].
Ä Incubar as placas a 37ºC por 24 a 48 horas
Espalhamento “Pour Plate”: Consiste em fazer uma prévia diluição da amostra e colocar em uma placa de Petri vazia e depois derramar o meio sobre a amostra e agitar para homogenizar a amostra diluída com o meio de cultura. Técnica:
Ä Fazer diluição seriada da amostra, ex. 1/10, 1/100 e 1/1000.
Ä Colocar 1 ml de cada diluição em uma placa de Petri estéril
Ä Fundir 10 ml de meio sólido e refriar a 65ºC
Ä Derramar sobre a amostra na placa e aplicar movimentos suaves na placa para misturar a amostra com o meio;
Ä Esperar o meio solidificar novamente e incubar as placas a 37ºC por 24 a 48 horas
Espalhamento Pos Plate: Consiste em espalhar a amostra diluída ou não sobre o meio com auxilio da alça de Drigalsky, para obter colônias isoladas.
Interpretação: Observar as colônias isoladas, caracterizadas pela formação de pontos isolados sobre o meio de cultura, após a incubação.
Recomendações Para Semeadura de Material Biológico
Para execução de uma boa semeadura, certas precauções especiais devem ser observadas pelo manipulador, com o fim de preservar a pureza do cultivo e minimizar os riscos de infecção ou intoxicação no Laboratório:
· Todo processo deve ser feito em ambiente limpo e desinfectado, próximo de uma chama “azul” de um bico de Bunsen, ou então dentro de uma câmara de fluxo laminar;
· Alça de platina utilizada para semear, deve ser flambada antes e depois da semeadura;
· As placas semeadas devem ser incubadas com tampa invertida para não haver transpiração do meio sobre a tampa
· Regular a entrada de ar do bico de Bunsen, para obter uma chama azul ( zona de esterilidade );
· Os tubos ou recipientes com meios de cultura, estéreis ou com material a ser inoculado, deverão ser abertos ou manipulados, somente na proximidade da chama do bico de Bunsen (zona estéril);
· As manipulações devem ser feitas, preferencialmente, por trás da chama do bico de Bunsen.
· As alças ou agulhas, de platina ou níquel-cromo, devem ser flambadas imediatamente antes e depois de qualquer transferência. Elas devem ser flambadas em todo seu comprimento, a partir de alguns centímetros do cabo de Kolle, até ao rubro, mantendo-as em posição vertical à chama do bico de Bunsen. Nunca iniciar a flambagem pela extremidade livre da alça ou agulha. Deixar esfriar nas proximidades da chama;
· Passar, ligeiramente, dentro da chama do Bico de Bunsen, imediatamente antes e depois da transferência, pipetas graduadas estéreis, pipeta Pasteur, ou alça de Drigalsky;
· Nunca abrir ou deixar aberto verticalmente os tubos ou frascos com culturas, incliná-los a aproximadamente em ângulo de 30º;
· No caso de tubo com ágar inclinado, este deve ficar de preferência na horizontal. Flambar também a boca dos tubos ou frascos contendo culturas e meios, imediatamente antes e depois da transferência;
· Nunca depositar a tampa ou tampão de algodão dos tubos ou frascos sobre a bancada ou mesa de trabalho;
· Descartar pipetas usadas em recipientes contendo soluções detergentes ou desinfetantes;
· Tratar de dispor o material de trabalho em posição adequada à fácil manipulação, sem riscos de acidentes ou trocas. Manter os tubos, alças e agulhas sempre na posição vertical, em suportes e estantes apropriadas;
· Identificar adequadamente o material de trabalho.
8. ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE ESTAFILOCOCOS
Material: Placas de ágar-sangue, de Chapman-Stone e ágar DNAse, cultivadas S.aureus de um lado e S.epidermidis do outro lado; Lâmina de microscópio, bico de Bunsen, bateria de corante de Gram, tubinhos (120mm), 2 pipetas de 2ml, 2 tubos contendo 2ml de salina, água oxigenada a 3%, alça de platina, plasma de coelho, Solução de bromocresol, placa contendo ágar Mueller-Hinton, disco de novobiocina, ácido clorídrico 1N, pipeta Pasteur.
Método: Observar as placas com cultura bacteriana, anotar as características coloniais e realizar os seguintes testes:
· Coloração de Gram
· Prova da catalase:
· Prova da Coagulase:
· Fermentação do manitol:
· Tolerância ao NaCl
· Sensibilidade a novobiocina
Coloração de Gram
· Fazer esfregaços em lâminas e fixar pelo calor
· Cobrir a área do esfregaço com a solução de cristal-violeta por cerca de 1min.;
· Lavar com água corrente e escorrer o excesso de água;
· Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de 1 minuto;
· Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra incolor;
· Cobrir o esfregaço com a solução de safranina por cerca de 30 segundos;
· Lavar com água corrente;
· Deixar secar ao ar .
Os estafilococos são visualizados como cocos Gram-positivos (roxo) isolados e agrupados em forma de cachos de uva
Prova da Catalase
A catalase presente na maior parte das bactérias atua na reação:
 |
2H2O2 catalase 2H2O + O2
Colocar em um tubinho (120mm) 1 ou 2 ml de água destilada, emulsionar quantidade suficiente de colônias de Staphylococcus aureus para obter uma suspensão espessa; acrescentar-lhe 3 gotas de água oxigenada a 3%. Não agitar. O desprendimento de bolhas de gás indica a presença de catalase.
Prova da coagulase:
Enzima que, reagindo com um co-fator existente no plasma de certas espécies (coelho, cavalo, humano), transforma o fibrinogênio em fibrina.
O co-fator plasmático é indistinguível da protrombina, porém a enzima se diferencia da tromboquinase pois, ao contrário desta última, não requer a presença de ions Ca+2, nem dos fatores 5, 6 e 7 para sua ativação.
Teste: Misturar 0,5ml de cultura em caldo simples ou de suspensão espessa de estafilococos a 0,25ml de sangue total ou plasma de coelho oxalatado a 0,2% ou citratado a 1%. Leitura após 2 a 4 horas a 37ºC.
Prova presuntiva em lâmina: Emulsionar homogeneamente uma alça do induto bacteriano em uma gota de salina. Misturar uma alça de plasma e agitar circularmente. Reação positiva: formação de grumos em 2 segundos. Reação negativa será controlada pelo teste em tubo.
Plasma de coelho 1/5 (para prova de coagulase)
Sol. de citrato de sódio a 3,8%.... 2,5ml
Sangue de coelho...................... 10,0ml
|
Separar o plasma (centrifugar a 2000 rpm durante 20min.), diluir a 1/5 em solução fisiológica.
|
Fermentação do Manitol e Tolerância ao NaCl
Semear a bactéria no meio de Chapman-Stone (item 8.5.15). O meio fornece três respostas: a) pigmentação; b) fermentação da manita – adicionar 1 gota de sol. de bromocresol às áreas de onde se removeram colônias tipicamente pigmentada; c) produção de gelatinase – halo claro em torno das colônias
Sensibilidade à Novobiocina
Fazer uma suspensão da bactéria em salina estéril. Com swab estéril semear por espalhamento a bactéria sobre o meio de Mueller-Hinton. Colocar um disco de novobiocina no centro da placa. Incubar a 37ºC por 24 a 48horas. A leitura é feita pela observação da presença (S) ou não (R) de zona de inibição ao redor do disco.
Desoxirribonuclease (DNAse)
“DNase Test Ágar” (Difco ou BBL) ......... 42,0g
Água destilada ....................................... 1000ml
|
Fundir e esterilizar a 120°C, 15 minutos. Distribuir em placas de Petri.
Inocular em pontos definidos, sem estriação. Após crescimento, revelar com solução de ácido Clorídrico 1N. Uma zona transparente em torno do crescimento, após opacificação do ácido nucléico residual pelo ácido clorídrico, indica um teste positivo.
Interpretação:
Em ágar sangue as colônias de estafilococos apresentam-se com coloração branca ou amarelada, opacas, cremosas e convexas, sendo que algumas cepas bacterianas produzem beta-hemólise.
O primeiro passo para a identificação presuntiva das colônias de estafilococos consiste na confecção de um esfregaço e posterior coloração pelo método de Gram, onde este grupo bacteriano apresenta-se agrupado caracteristicamente na forma de “cachos de uva”.
Quando não se consegue a diferenciação entre estafilococos e estreptococos, é recomendável a utilização da prova da catalase.
A catalase não é produzida pelos estreptococos , e a prova, que pode ser realizada em lâmina ou em tubo, se positiva, caracteriza a presença dos estafilococos.
Após a caracterização de uma colônia como sendo estafilococo, o passo seguinte consiste em identificar se esta é ou não S. aureus. Como relatado anteriormente, a prova da coagulase é utilizada pela maioria dos laboratórios para a identificação presuntiva desta espécie.
As cepas bacterianas coagulase negativa identificadas pelos métodos ordinários, S. epidemidis e S. saprophyticus, têm sua diferenciação através da prova de sensibilidade à novobiocina sendo que a maior parte das cepas de S.saprophyticus é resistente a este antibiótico ao contrário do S. epidemidis que mostra-se sensível.
A fermentação do manitol e a prova da desoxiribonuclease já foram muito utilizadas na diferenciação das espécies de estafilococos, entretanto sua utilização atual encontra-se limitada.
Abaixo têm-se os resultados das provas de coagulase, manitol, DNAse e novobiocina para as três espécies clínicas de estafilococos de maior importância.
9.ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE ESTREPTOCOCOS
Material: Bateria de coloração de Gram, tubinho (120mm), pipetas de 2 ml, água oxigenada a 3%, Placas de ágar sangue e meio de bile-esculina dividida em três áreas, onde em cada uma área tem cultivado Streptococos alfa, beta e gama hemolíticos, placas com ágar sangue, discos de bacitracina, optoquina, caldo tripticase-soja (TSB), vermelho-fenol (0,02%) , solução de hidróxido de sódio 1N., solução de desoxicolato de sódio a 2%, salina estéril, desoxicolato de sódio a 2%, caldo cloretado, Meio com Teste Camp
Método: Observar as placas com cultura bacteriana, anotar as características coloniais, tipo de hemólise e realizar os seguintes testes:
· Coloração de Gram
· Catalase
· Reação hemolítica em àgar sangue,
· Sensibilidade à bacitracina,
· Sensibilidade à optoquina,
· Prova bile-esculina,
· Tolerância ao cloreto de sódio a 6,%,
· Bile-solubilidade
· Prova do CAMP
Coloração de Gram
· Fazer esfregaços em lâminas e fixar pelo calor
· Cobrir a área do esfregaço com a solução de cristal-violeta por cerca de 1min.;
· Lavar com água corrente e escorrer o excesso de água;
· Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de 1 minuto;
· Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra incolor;
· Cobrir o esfregaço com a solução de safranina1 por cerca de 30 segundos;
· Lavar com água corrente;
· Deixar secar ao ar .
Os estreptococos são visualizado como cocos Gram-positivos (roxo) isolados e agrupados em forma de cadeias
Prova da Catalase
A catalase presente na maior parte das bactérias atua na reação:
 |
2H2O2 catalase 2H2O + O2
Colocar em um tubinho (120mm) 1 ou 2 ml de água destilada, emulsionar quantidade suficiente de colônias de Streptococcus sp. para obter uma suspensão espessa; acrescentar-lhe 3 gotas de água oxigenada a 3%. Não agitar. O não desprendimento de bolhas de gás indica a ausência de catalase.
Reação hemolítica em ágar sangue
Teste: Semear a bactéria em ágar sangue, incubar a 37ºc por 24 a 48 horas. Observar o tipo de hemólise.
De acordo com a característica apresentada em àgar sangue de carneiro os estreptococos podem ser caracterizados como sendo do tipo alfa, beta ou gama.
O tipo de hemólise produzido é muito útil para a identificação inicial dos estreptococos; entretanto, deve se ter o cuidado com a origem do sangue visto que havendo esta variação pode haver mudança no comportamento do estreptococo quanto à produção da hemólise. Um cuidado adicional que também deve-se ter é quanto à escolha do àgar base para a preparação do àgar sangue. Recomenda-se, para que sejam evidenciadas as propriedades líticas dos estreptococos em meio isento de açúcares redutores.
Os estreptococos alfa hemolíticos caracterizam-se por apresentar uma hemólise incompleta, além de possuir uma coloração esverdeada, daí serem denominados de “viridans”.
Os estreptococos beta hemolíticos produzem hemólise clara e completa, frequentemente amarelado e os estreptococos do tipo gama, de menor importância clínica, nâo produzem hemólise.
Sensibilidade à Bacitracina,
O inóculo poderá ser obtido a partir do crescimento em meio de Todd Hewitt (T.H,) ou, quando possível, diretamente de colônias de ágar-sangue. O caldo T.H. pode ser substituído por outro que propicie crescimento abundante.
Semear em ágar-sangue uma área retangular (2cm de largura e 4cm de comprimento, aproximadamente). Depositar o disco de bacitracina no centro desta área. Incubar 35 a 37°C por 18 a 24 horas. Cada placa de ágar-sangue comporta 4 testes.
Normas recomendadas para a realização e interpretação do teste da bacitracina (Sonnenwirth, 1983):
ØUsar apenas discos de diferenciação com 0,04m. Os discos para antibiograma que contém lm não se prestam para os testes.
ØTrabalhar com inóculos espessos e de cultura pura, para evitar que espécies de outros grupos demonstrem falsa sensibilidade em decorrência da escassez de microrganismos.
ØTestar amostras comprovadamente beta-hemolíticas, pois alguns Streptococcus alfa também são sensíveis à bacitracina 0,04m.
ØConsiderar qualquer halo de leitura como sensível.
Sensibilidade à Optoquina.
A semeadura é feita como a descrita para a bactracina.
Incubar a 35°C 18 horas em microaerofilia.
Os halos de sensibilidade serão considerados em função do diâmetro dos discos.
Discos medindo 6mm - halos 14mm ou mais: sensível
- halos entre 6 a 14mm: questionável
Discos medindo10mm - halos 16 ou mais: sensível
- halos entre l0 a 16mm: questionável
Os testes questionáveis serão confirmados pela bile-solubilidade.
Prova Bile-Esculina
lnocular duas a três colônias ou uma alçada de crescimento do meio de bile-esculina (item 8.5.21). Este meio é distribuído em tubos com camada inclinada. lnocular o bísel. lncubar a 35ºC, por 48 horas.
Considera-se a prova como positiva quando mais da metade do bísel ficar enegrecido em 48 horas.
Bile-Solubilidade
Este teste poderá ser realizado empregando-se meio de cultura liquido com crescimento de Streptococcus pneumoniae ou diretamente na placa de Petri com crescimento deste microrganismo. Neste caso, poderá ser aproveitada a placa utilizada no teste da optoquina, procurando analisar o crescimento mais afastado possível do disco.
A partir do crescimento em ágar-sangue, semear 3 a 4 colônias em caldo Todd-Hewitt ou caldo tripticase-soja (TSB), incubando de um dia para outro. Após crescimento, transferir 0,5ml para dois tubos estéreis de 13 x 100mm, adicionando em seguida vermelho-fenol (0,02%) e ajustando o pH na faixa de 7,0 com solução de hidróxido de sódio. Adicionar em seguida 0,5ml da solução de desoxicolato de sódio a 2% em um dos tubos e 0,5ml de salina a 0,85% no outro tubo. Incubar a 35ºC e examinar de meia em meia hora no período de 2 horas. O teste será considerado positivo quando houver lise ou solubilidade dos microrganismos no tubo contendo desoxicolato de sódio. O tubo-controle com salina permanecerá turvo. Algumas cepas de Streptococcus pneumoniae apresentam uma solubilidade parcial. Neste caso, serão classificados como tal, quando o teste da optoquina for positivo
Como foi dito, pode-se realizar o teste da bile-solubilidade diretamente na placa de Petri com o crescimento em ágar-sange, onde foi realizado teste de optoquina. Neste caso, pinga-se uma gota de desoxicolato de sódio a 2%, incubando-se em seguida a 35°C, durante 30 minutos, mantendo-se a placa de Petri voltada para cima. A lise do crescimento é característica de Streptococcus pneumoniae
Tolerância ao Cloreto de Sódio A 6,5%,
Inocular duas a três colônias em caldo cloretado (8.5.22). O teste será positivo quando houver turvação do meio indicando crescimento.
Prova do CAMP
Semear em ágar-sangue uma única estria da amostra-padrão de Staphylococcus aureus produtora de beta-hemolisina e, perpendicularmente a uma distância de 0,5 cm, semear a amostra a ser testada, cuidando-se para que as estrias não se encontrem. Incubar entre 35 e 37ºC por l8 a 24 horas.
Em provas positivas, na região de confluência entre as linhas dos dois microrganismos, ocorre lise total das hemácias, com configuração de meia lua ou ponta de seta.
Interpretação:
· Coloração de Gram: Cocos Gram-positivos isolados e agrupados em cadeias
· Catalase: Negativa
· Reação hemolítica em ágar sangue: tipo beta, alfa e gama
· Sensibilidade à bacitracina: Sensível
· Sensibilidade à optoquina: Sensível
· Prova bile-esculina: positivo
· Tolerância ao cloreto de sódio a 6,%: (+) p/ Enterococos; (-) não enterococos
· Bile-solubilidade: (+) p/ S.pneumoniae; (-) S.viridans
· Prova do CAMP: positivo
10. ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE ENTEROBACTERIAS
10.1. COPROCULTURA
Material: Amostra de fezes[3], ágar verde-brilhante ( Kristensen), ágar E.M.B, ágar SS e caldo selenito ou tetrationato, alça de platina, bico de Bunsen, estufa a 37ºC.
Metodologia:
· Semear as fezes pelo método de esgotamento, nos seguintes meios de cultura: ágar verde-brilhante (Kristensen) , ágar EMB, ágar SS e ágar-sangue.
· Incubar os meios a 37ºC por 24 a 48 horas.
· Observar as características da colônias e proceder a identificação (provas bioquímicas)
· A semeadura deve ser feita com alça de platina ou bastão em L (espátula de Drigalsk), em três setores de cada placa, de maneira a esgotar progressivamente o inóculo, com vistas à obtenção de colônias isoladas.
· Semear primeiro os meios de ágar verde-brilhante (Kristensen) e ágar SS e, sem recarregar a alça, passar para o meio E.M.B ou Mac Conkey.
· Para o enriquecimento, semear um fragmento de fezes mais ou menos do tamanho de uma ervilha (ou, em se tratando de fezes líquidas ou de suspensão em meio de transporte, cerca de 1 a 2 ml) em tubos de caldo selenito.
· Incubar a 37ºC e após 18-24 horas, transportar para os meios de isolamento (Kristensen, SS e EMB).
Interpretação:
No meio de Kristensen (ágar verde brilhante), as colônias de salmonella são róseas, transparentes e circulares; os Proteus são inibidos e crescem apenas na variante “O”, formando colônias róseas circunscritas; os coliformes são inibidos substancialmente, porém os que se desenvolvem produzem colônias opacas e amarelas. Quanto às Shigellas, não se desenvolvem no meio de Kristensen.
Em ágar SS, crescem bem tanto as Salmonellas quanto as Shigellas, sob a forma de colônias circulares, incolores e transparentes; os Proteus dão colônias “O” que só se distinguem das colônias de Salmonella por serem um pouco maiores e menos transparentes e os coliformes são inibidos ou formam colônias vermelhas.
Em ágar EMB, as Salmonellas e Shigellas crescem sob a forma de colônias róseas, transparentes, ao passo que os coliformes produzem colônias negras (Escherichia coli) ou colônias mucóides róseas, com centro negro (Enterobacter); os Proteus são inibidos e tendem a formar um véu invasor.
10.2. IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA - ENTEROBACTERIACEAE
Material: Placas com colônias isoladas de bactérias Gram-negativas, meios de identificação (EPM, MILI e CIT), alça de platina.
Método: Com as placas contendo colônias isoladas de bactérias Gram-negativas, observar as características das colônias, “pescar” a colônia suspeita, e semear nos seguintes meios de identificação presuntória: EPM[4], MILI e CIT. Para inocular o meio EPM, introduzir a agulha até o fundo do tubo e ao retirá-la semear a superfície do meio. A inoculação do MILI deve ser feita por picada central, introduzindo a agulha até o fundo do tubo. Incubar a 37ºC por 18-24horas. Fazer a leitura das seguintes provas bioquímicas:
EPM
|
MILI
|
CIT
|
Fermentação da glicose
Produção de gás
Produção de H2S
Hidrólise da uréia
Desaminação do Triptófano
|
Motilidade
Produção de Indol *
Descarboxilação da lisina
|
Metabolização do citrato
|
(*) Adicionar uma gota do reativo de Kovacs e verificar o aparecimento da cor velmelha em forma de anel na superfície do meio
Interpretação: Averiguar as características bioquímicas e procurar na tabela em anexo o germe que mais se assemelha às características
MEIO EPM
· Fermentação da glicose: cor amarela
· Produção de gás: formação de bolhas ou deslocamento do meio do fundo do tubo
· Produção de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade
· Hidrólise da uréia: Aparecimento da cor azul ou verde-azulada (reação fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou não
· Desaminação do Triptofano: aparecimento de cor verde-garrafa no superfície do meio. Quando a reação é negativa, a superfície do meio adquire cor azul ou, raramente, amarela
MEIO MILI
· Motilidade: a bactéria móvel cresce além da picada turvando parcial ou totalmente o meio. A bactéria imóvel cresce somente na picada.
· Descarboxilação da Lisina: quando a lisina é descarboxilada, o meio adquire cor púrpura acentuada ou discreta. Quando o aminoácido não é utilizado, o meio adquire cor amarela nítida nos seus 2/3 inferiores. Considerar o teste positivo sempre que o meio não estiver amarelo
· Produção de indol: após a leitura dos testes de motilidade e lisina, adicionar 3 a 4 gotas de reativo de Kovacs a superfície do meio e agitar levemente. Quando a bactéria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando não o produz, o reativo mantém a sua cor inalterada
CITRATO: a utilização do citrato revela-se pelo aparecimento de cor azul na superfície do meio. O teste deve ser considerado negativo quando a cor do meio não sofrer alteração
Características dos germes da familia Enterobacteriaceae nos meio EPM-MILI-CIT.
EPM
|
MILI
|
CIT
|
GERMES
|
Base amarela e superfície azul. Ausência de bolha de gás e de enegrecimento: Gás (-); Gli (+), H2S(-), Urease (-), Trip (-)
|
Cor amarela, crescimento somente na picada; indol +/-
|
Verde (-)
|
Shigella (dysenteriae, flexneri e boydii)
|
Base amarela e superfície azul. Ausência de bolhas de gás e de enegrecimento: Gli (+),Gás (-), H2S(-), Urease (-), Trip (-)
|
Cor amarela, crescimento somente na picada; indol negativo
|
Verde (-)
|
Shigella sonnei
|
Base amarela e superfície azul com ou sem bolhas de gás. Ausência de enegrecimento: Gli (+),Gás (+/-), H2S(-), Urease (-), Trip (-)
|
Cor amarela, crescimento somente na picada; indol positivo
|
Verde (-)
|
Escherichia coli invasora
|
Base amarela e superfície azul, geralmente com bolhas de gás. Ausência de enegrecimento: Gli (+),Gás (+/-), H2S(-), Urease (-), Trip (-)
|
Cor púrpura, turvação parcial ou total; indol –positivo
|
Verde (-)
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Escherichia coli clássica enterotoxigênica e outras
|
Base amarela e superfície azul. Presença de bolhas de gás e de enegrecimento: Gli (+), Gás (+), H2S(+), Urease (-), Trip (-)
|
Cor púrpura, turvação parcial ou total; indol – negativo
|
Verde (-)
|
Salmonella
|
Meio azul na base e na superfície. Ausência de bolhas de gás e de enegrecimento: Gli (-), Gás (-), H2S(-), Urease (+), Trip (-)
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Cor amarela, crescimento somente na picada; indol negativo (as vezes positivo).
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Verde (-)
|
Yersinia enterocolítica
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11.CULTURA DE URINA (UROCULTURA)
Material: Ágar Cled ou ágar Brolacin, pipetas de 1ml e de 10ml, tubos contendo 4,5ml de salina estéril, lâminas, lamínulas, bateria de Gram, centrífuga, tubos de centrífuga, microscópio
Método:
Exame microscópico: O exame microscópico é feito com dois objetivos:
a) para a verificação de piúria;
· Transferir 10ml de urina para um tubo e centrifugar por 5min. a 2000 rpm;
· Desprezar o sobrenadante e examinar o sedimento entre lâmina e lamínula em objetiva de 40 X, determinando o nº de leucócitos por campo (eritrócitos, cristais, cilindros, ..)
b) para análise bacterioscópica:
· Com o sedimento da urina centrifugada, fazer um esfregaço na lâmina, fixar e corar pelo método de Gram
· Observar a flora Gram-positiva e ou Gram-negativa, estimar a população bacteriana, bem como a presença de leucócitos mono e polimorfonucleares.
Exame quantitativo: Consiste em fazer uma prévia diluição da urina e colocar em uma placa de Petri vazia estéreis e depois derramar o meio sobre a amostra e agitar para homogeneizar a amostra diluída com o meio de cultura. Técnica:
Ä Enumerar 4 tubos contendo 4,5ml de salina estéril (10-1 , 10-2 ,10-3 e 10-4 );
Ä Adicionar assepticamente, 0,5ml da urina no primeiro tubo (10-1), homogeneizar e transferir 0,5ml da mistura para o segundo tubo (10-2); homogeneizar e transferir 0,5ml da mistura para o terceiro tubo (10-3); homogeneizar e transferir 0,5ml da mistura para o quarto tubo (10-4);
Ä Enumerar 2 placas estéreis vazias (10-3 e 10-4 )
Ä Colocar 1ml da mistura do tubo (10-3) na placa (10-3); e 1ml da mistura do tubo (10-4) na placa (10-4)
Ä Fundir 10 ml de ágar Cled e refriar a 65ºC
Ä Derramar o ágar Cled fundido dentro das placas (10-3) e (10-4) e aplicar movimentos suaveis na placa para misturar a amostra com o meio;
Ä Esperar o meio solidificar novamente e incubar as placas a 37ºC por 24 a 48 horas
Ä Fazer a contagem das colônias nas placas e determinar o nº de colonias/ml da urina, multiplicando o número de colônias encontrado pelo fator de diluição (10-3 ou 10-4)
obs: A placa utilizada para contagem é aquela em que ocorrer crescimento entre 100 a 300 colônias.
Ä Com as colônias isoladas, proceder a identificação do germe
12. TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
Material: Placas contendo ágar Mueller-Hinton, Microrganismo isolado em cultura pura (E.coli ou S.aureus) e suspenso em salina (inóculo)
Metodo:
Preparo do inóculo: Tomar 4 a 6 colônias do cultivo puro e inocular em um tubo com caldo BHI. Incubar o tubo por 2 a 5 horas até obter uma suspensão com turvação moderada. O inóculo deve ser adequadamente padronizado, pois caso contrário o resultado do antibiograma poderá ser alterado significativamente. Preparar as diluições de cada cultura em solução salina fisiológica até que a turbidez das suspensões ajustem-se a 108 bactérias/ml. Comparar as suspensões contra um padrão de turvação (0,5ml de BaCl2.2H2O 0,048M em 99,5ml de H2SO4 0,36N) preparado mensalmente.
Semeadura: Utilizar um “swab” estéril para cada cultura, imergindo-o no “inóculo” . Esgotar o excesso de líquido, apertando o “swab” contra a parede do tubo e semear cada microrganismo em ágar Mueller-Hinton em diferentes sentidos, assegurando uma semeadura uniforme.
Aplicação dos discos: Mantendo sempre a assepsia, depositar com uma pinça estéril (imersa no álcool ou flambada na chama) os discos de antibióticos indicados sobre a superfície do inóculo em placa de ágar. Em seguida, com pinça estéril, exercer uma leve pressão sobre cada disco, para se obter uma boa aderência, a fim de permitir um contato do disco com a superfície do ágar. Caso contrário, poderá ocorrer erros na leitura dos resultados, devido a difusão não uniforme do antibiótico no ágar. Não se deve colocar mais de 9 discos por placas de 100mm, assim como, é muito importante levar em conta a distância entre eles.
Incubação: Depois de trinta minutos, as placas devem ser incubadas invertidas a 37ºC durante 16 a 18 horas.
Leitura: Observar e medir o halo de inibição, compararando com a tabela fornecida pelo fabricante para determinar a susceptibilidade aos antibióticos: S (Sensível), R (Resistente) e I (Intermediário)
| RESISTÊNCIA Escolha a(s) que mais se adeque(m) |
13. TÉCNICA DE MICROCULTIVO PARA FUNGOS
Material: placa contendo ágar sabouraud, placa de Petri, lâmina, lamínula, chumaço de algodão hidrófilo, papel de embrulho, estilete ou alça de platina estéril, Inoculo de fungo (Rhizopus, Penicillium e Aspergilus), pipetas, gota de azul de metileno, microscópio.
Metodologia:
· Colocar dentro de uma placa de Petri, uma lâmina, uma lamínula e um chumaço de algodão hidrófilo, acondicionar em papel de embrulho e esterilizar por autoclavação;
· Com auxílio de um estilete ou alça de platina estéril, cortar o ágar Sabouraud em pedaço quadrados de ±15mm e depositar sobre a lâmina que está dentro da placa;
· Inocular o fungo (ou material biológico) nos 4 lados do pedaço do ágar e cobrir com a lamínula;
· Adicionar cerca de 2ml de água estéril ao chumaço de algodão dentro da placa[5] e incubar a placa a 28ºC por 24 a 72 horas
· Após o crescimento do fungo, retirar cuidadosamente a lamínula e colocar sobre uma gota de azul de metileno depositada no centro de uma lâmina.
· Observar ao microscópio em lente de 40X
Interpretação: Observar as estruturas que formam os esporos, bem como a disposição das hifas (desenhar e comparar com o manual )
[1] Ou Fucsina de Ziehl diluida 1/10
[2] Tomar cuidado para não ferir o meio de cultura.
[3] Dar preferência às fezes com muco, pus e sangue. Recomenda-se o uso de uma solução glicerinada tamponada, como meio preservador para o preparo de uma suspensão de fezes, a qual deve ser de uma evacuação recente.
[4] Meio de Rugai, modificado por alunos da Escola Paulista de Medicina
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